从1474年直到驾崩，伊莎贝拉一世一直是卡斯蒂尔女王。伊莎贝拉一世与斐迪南二世的联姻是西班牙在查理五世时代实现政治统一的基础。经过一场争夺王位的战争后，伊莎贝拉一世重新组织政治体系，将卡斯蒂尔王国的犯罪率降到了最低水平，解决了其哥哥恩里克四世在位时留下的巨额债务。伊莎贝拉一世与斐迪南二世的改革影响范围远远超过他们的联合王国的边界。伊莎贝拉一世和斐迪南二世以收复失地、驱逐摩尔人和犹太人及1492年资助克里斯托弗·哥伦布远航而闻名。克里斯托弗·哥伦布的远航发现了新世界，确立了西班牙作为欧洲乃至世界大部分地区第一个长达一个多世纪的全球大国地位。
1451年4月22日，伊莎贝拉出生于阿维拉马德里加尔德拉萨尔托雷斯，是卡斯蒂尔国王胡安二世与其第二任妻子葡萄牙的伊莎贝拉的女儿。伊莎贝拉一世出生时，她同父异母的哥哥恩里克是卡斯蒂尔王国王位的第一继承人，而伊莎贝拉是王位的第二继承人。此时，恩里克二十六岁，已经结婚，但无子嗣。1453年11月17日，伊莎贝拉的弟弟阿斯图里亚斯亲王阿方索出生，伊莎贝拉成了王位的第三继承人。1454年，伊莎贝拉的父亲驾崩，伊莎贝拉同父异母的哥哥恩里克登上王位，史称“恩里克四世”。后来，伊莎贝拉、伊莎贝拉的母亲及阿方索搬到阿雷瓦洛。
在阿雷瓦洛的城堡里，他们的生活条件很差，同时他们很缺钱。尽管伊莎贝拉的父亲胡安二世在遗嘱中为子女的生活做了很好的安排，但恩里克四世要么是为了限制同父异母的弟弟、妹妹，要么是因为自己无能，所以并未遵从父亲的遗嘱。虽然生活条件艰难，但在母亲的精心照料下，伊莎贝拉接受了严格的宗教教育，并对宗教极其虔诚。恩里克四世的妻子葡萄牙的胡安娜快要生下女儿乔安娜·拉·贝尔特拉内加时，伊莎贝拉和弟弟阿方索被召回塞戈维亚的王宫，接受恩里克四世的直接监管并完成学业。
胡安二世
葡萄牙的胡安娜
在塞戈维亚，伊莎贝拉的生活条件有所改善。她住在城堡里，衣食无忧。伊莎贝拉的基础教育包括阅读、拼写、写作、语法、数学、艺术、舞蹈、音乐及宗教课程。她与侍女们通过音乐自娱自乐，过着轻松自在的生活。由于恩里克四世的禁令，伊莎贝拉几乎没有离开过塞戈维亚。恩里克四世一直让伊莎贝拉远离动荡的政治。不过，伊莎贝拉对于发生的一切了如指掌。
乔安娜·拉·贝尔特拉内加
贵族们热衷于权力。他们与恩里克四世对峙，要求恩里克四世指定其同父异母的弟弟阿方索为王位继承人。他们甚至鼓动阿方索篡夺王位。此时，贵族们控制着阿方索，声称阿方索才是真正的继承人。1467年，在第二次奥尔梅多战役中，贵族势力与恩里克四世的军队发生冲突。这场战役最终不分胜负。恩里克四世同意承认阿方索为王位继承人，但前提是阿方索要娶恩里克四世的女儿乔安娜·拉·贝尔特拉内加公主为妻。阿方索被封为阿斯图里亚斯亲王，但不久就于1468年7月薨了。他很有可能死于瘟疫。支持阿方索的贵族怀疑阿方索死于中毒。阿方索在遗嘱中指定伊莎贝拉为王位继承人，贵族们便要求伊莎贝拉接替阿方索成为反对恩里克四世的势力的领导者。然而，伊莎贝拉对反对势力的支持力度开始减弱，她更愿意通过谈判结束持续不断的纷争。伊莎贝拉在吉桑多托洛斯与恩里克四世见面，并达成一致：停止纷争。恩里克四世指定王位继承人为伊莎贝拉而不是自己的女儿乔安娜·拉·贝尔特拉内加；没有恩里克四世的准许，伊莎贝拉不能结婚；恩里克四世也不能强迫伊莎贝拉违背其意愿结婚。伊莎贝拉尽管没有正式推翻恩里克四世的统治，但还是实现了贵族们的大部分意愿。伊莎贝拉当时的势力不足以推翻恩里克四世的统治，况且她也不希望破坏公平的继承原则。正是基于此，伊莎贝拉认为合法性是王位继承的基础。
伊莎贝拉六岁时就与阿拉贡王子斐迪南订下婚约。斐迪南是纳瓦拉国王胡安二世的小儿子，也出自特拉斯塔马拉家族。当时，恩里克四世和胡安二世都迫切希望通过斐迪南与伊莎贝拉的联姻向世人展示两国之间永恒的友谊。但这种安排并未持续多久。
1458年，斐迪南的叔叔阿方索五世驾崩。阿方索五世所有的西班牙领土及西西里岛和撒丁岛都留给了自己的弟弟胡安二世。此时，胡安二世的地位比以往任何时候都稳固。因此，胡安二世不再需要恩里克四世的支持。恩里克四世需要结成新的联盟。他在胡安二世的长子维亚纳亲王查理的身上发现了新的机会。维亚纳亲王查理经常与父亲胡安二世发生争执。最后，维亚纳亲王查理秘密与恩里克四世结盟。他们结盟的一个主要内容是维亚纳亲王查理与伊莎贝拉联姻。胡安二世知道此事后极其生气。他本来安排伊莎贝拉与自己偏爱的小儿子斐迪南结婚。因此，在胡安二世眼中，维亚纳亲王查理与恩里克四世的结盟仍然无效。胡安二世以维亚纳亲王查理谋害自己的罪名将其投入监狱。1461年，维亚纳亲王查理薨。
阿方索五世
维亚纳亲王查理
维亚纳亲王查理薨
1465年，恩里克四世试图将伊莎贝拉嫁给自己的内兄葡萄牙国王阿方索五世。在葡萄牙王后阿拉贡的埃莉诺和莱德斯马伯爵的撺掇下，一个新的联盟结成。但伊莎贝拉对婚事非常谨慎，不同意这桩婚事。
因为恩里克四世的无能，卡斯蒂尔王国爆发了内战。恩里克四世此时需要尽快取悦反对势力。作为和平协议的一部分，伊莎贝拉将与佩德罗·吉恩·阿库·帕切科订婚。佩德罗·吉恩·阿库·帕切科是卡拉特拉瓦骑士团的团长，也是恩里克四世的亲信胡安·费尔南德斯·帕切科的弟弟。作为回报，佩德罗·吉恩·阿库·帕切科将给贫穷的王室一大笔钱。恩里克四世别无他路，只得同意了这桩婚事。伊莎贝拉十分震惊。她向上帝祈祷，希望这桩婚事无果而终。伊莎贝拉的祈祷得到了回应，佩德罗·吉恩·阿库·帕切科在去见伊莎贝拉的路上暴卒。
1468年9月19日，恩里克四世承认伊莎贝拉为其王位继承人时，就承诺不会违背伊莎贝拉的意愿强迫她结婚。与此同时，伊莎贝拉答应自己的婚事会寻求恩里克四世的准许。多年来政治联姻的失败尝试似乎终于要结束了。有人说伊莎贝拉会和英王爱德华四世结婚，也有人说她会和爱德华四世的其中一个兄弟，或许是当时的格洛斯特公爵、后来的英王理查三世结婚。不过，这种可能性似乎从未被认真考虑。1468年，葡萄牙的阿方索五世再次提出联姻请求。恩里克四世企图违背自己1468年9月19日的承诺，让伊莎贝拉答应这桩婚事。如果伊莎贝拉答应嫁给阿方索五世，恩里克四世的女儿乔安娜·拉·贝尔特拉内加将嫁给阿方索五世的儿子胡安二世。这样一来，阿方索五世驾崩后，胡安二世和乔安娜·拉·贝尔特拉内加将继承葡萄牙王国和卡斯蒂尔王国。不过，伊莎贝拉拒绝了阿方索五世的联姻请求，并且秘密答应嫁给第一任未婚夫阿拉贡王国的斐迪南。
爱德华四世
理查三世
恩里克四世的计划落空后，他再次违背当初的诺言，试图让伊莎贝拉嫁给法王路易十一的弟弟贝里公爵瓦卢瓦的查理。恩里克四世认为，与法兰西王国联姻将巩固两国之间的友谊。伊莎贝拉再次拒绝了恩里克四世。与此同时，阿拉贡国王胡安二世秘密与伊莎贝拉协商她与斐迪南的婚礼。
1469年10月18日，伊莎贝拉与斐迪南正式订婚。斐迪南和伊莎贝拉是第二代堂兄妹。基于血缘关系，他们是不能结婚的，除非得到教皇的特许，否则这桩婚姻就是不合法的。在瓦伦西亚红衣主教罗德里戈·博尔吉亚——即后来的教皇亚历山大六世——的帮助下，伊莎贝拉和斐迪南得到教皇皮乌斯二世（已于1464年去世）签发的教皇诏书。诏书授权斐迪南与伊莎贝拉在三级血缘关系内结婚，他们的婚姻合法。伊莎贝拉担心恩里克四世反对。她以探访弟弟阿方索在阿维拉的墓地为名，逃出了卡斯蒂尔王宫，而斐迪南则伪装成仆人。1469年10月19日，他们在巴利亚多利德的比韦罗宫结婚。
教皇皮乌斯二世
伊莎贝拉加冕卡斯蒂尔女王
1474年12月12日，伊莎贝拉的哥哥恩里克四世在马德里驾崩的消息传到了塞戈维亚。这促使伊莎贝拉前往塞戈维亚城堡避难。她在塞戈维亚城堡得到了安德烈斯·德·卡布雷拉和塞戈维亚议会的支持。1474年12月13日，伊莎贝拉加冕卡斯蒂尔女王，史称“伊莎贝拉一世”。
伊莎贝拉一世执政初期并不顺利。恩里克四世曾经指定她为王位继承人，所以1474年继位时，已经有许多阴谋等着她。比列纳侯爵迭戈·洛佩兹·德·帕切科及追随者坚持认为恩里克四世的女儿乔安娜·拉·贝尔特拉内加是王位的合法继承人。迭戈·洛佩兹·德·帕切科提出自己的主张后不久，伊莎贝拉一世的长期支持者托莱多大主教阿方索·卡里略·德·阿库尼亚离开王宫去与迭戈·洛佩兹·德·帕切科（阿方索·卡里略·德·阿库尼亚的侄孙）策划。阿方索·卡里略·德·阿库尼亚与迭戈·洛佩兹·德·帕切科计划让乔安娜·拉·贝尔特拉内加嫁给葡萄牙国王阿方索五世，然后进攻卡斯蒂尔王国，从而夺取卡斯蒂尔王位。
阿方索·卡里略·德·阿库尼亚
1475年，阿方索五世率军进入西班牙，并进至普拉森西亚。阿方索五世与乔安娜·拉·贝尔特拉内加在普拉森西亚成婚。随后，一场漫长而血腥的卡斯蒂尔王位继承战争开始了。到1476年3月1日托罗战役开始时，这场战争持续了近一年。托罗战役后，双方都宣布取得了胜利：阿方索五世的军队被阿尔巴公爵加西亚·阿尔瓦雷斯·德·托莱多和红衣主教佩德罗·冈萨雷斯·德·门多萨指挥的卡斯蒂尔军队左翼的一支部队打败，而阿方索五世的儿子即后来的葡萄牙国王若昂二世率军击败卡斯蒂尔军队的右翼，仍然控制着战场。
托罗战役
尽管战争结果仍不明朗，但托罗战役代表着斐迪南二世和伊莎贝拉一世在政治上的重大胜利，因为乔安娜·拉·贝尔特拉内加的支持者解散了，没有盟友的葡萄牙军队也离开了卡斯蒂尔王国。正如历史学家胡斯托·L.冈萨雷斯所总结的：
两支军队在托罗对峙，一场战斗就此开始。尽管阿方索五世重组了自己的军队，但斐迪南二世向卡斯蒂尔王国所有城市及其他几个王国送去消息：卡斯蒂尔取得了巨大胜利。得知卡斯蒂尔王国取得胜利的消息后，乔安娜·拉·贝尔特拉内加的支持者就解散了，葡萄牙人也被迫返回自己的国家。
1476年8月，伊莎贝拉一世证明了自己作为一位强大统治者的能力。塞戈维亚爆发了叛乱，伊莎贝拉一世独自骑马前往塞戈维亚与叛乱势力谈判。伊莎贝拉一世取得成功，叛乱很快结束。两年后，1478年6月30日，伊莎贝拉一世的儿子阿斯图里亚斯亲王胡安出生，这进一步巩固了伊莎贝拉一世的统治地位。对许多人而言，男性继承人的出现使伊莎贝拉一世的统治地位合法化。
同时，卡斯蒂尔舰队和葡萄牙舰队都在争夺大西洋主导权及几内亚的财富——黄金和奴隶，甚至爆发了几内亚海战。
两国的战争持续了三年，最终以卡斯蒂尔王国在陆地取得胜利而葡萄牙在海洋取得胜利而告终。1479年9月4日，在阿尔卡索瓦斯签订的和平协议的结果是：葡萄牙放弃卡斯蒂尔王位，转而支持伊莎贝拉一世，以换取与卡斯蒂尔有争议的大西洋领域中非常有利的部分——除了加纳利群岛，其他有争议的领土都归葡萄牙所有，包括几内亚及其金矿、佛得角、马德拉群岛、亚速尔群岛、征服非斯王国的权利。葡萄牙还获得大笔战争赔偿金。伊莎贝拉一世和斐迪南二世答应乔安娜·拉·贝尔特拉内加留在葡萄牙而不是西班牙，并且宽恕所有支持乔安娜·拉·贝尔特拉内加和阿方索五世的人。
葡萄牙在阿尔卡索瓦斯获得了加纳利群岛南部所有大西洋专属航行权和贸易权，这意味着西班牙实际上被封锁在大西洋之外，也失去了几内亚的黄金。西班牙学者安东尼奥·鲁姆·德·阿马斯认为，因为1479年签署的《阿尔卡索瓦斯条约》，伊莎贝拉一世和斐迪南二世“……以极其昂贵的代价换得和平……”历史学家蒙塞拉特·里昂·格雷罗补充道，伊莎贝拉一世和斐迪南二世“……发现他们被迫放弃了在大西洋扩张的权利……”
后来，克里斯托弗·哥伦布把卡斯蒂尔王国从困境中解救出来。由于航海大发现，葡萄牙和西班牙于1494年在托德西利亚斯更加均衡地瓜分了大西洋。
正如克里斯托弗·哥伦布在1492年第一次远航时接到的命令所示：“（伊莎贝拉一世和斐迪南二世）一直铭记着《阿尔卡索瓦斯条约》的规定，因此斐迪南二世和伊莎贝拉一世坚持让克里斯托弗·哥伦布沿着加纳利群岛航行。”通过资助克里斯托弗·哥伦布向西远航，伊莎贝拉一世和斐迪南二世正尝试仅存的扩张之路。众所周知，伊莎贝拉一世和斐迪南二世最后收获了成功。伊莎贝拉一世从一开始就证明了自己是一位斗士，也是一位强大的君主。伊莎贝拉一世既然成功保住了自己在卡斯蒂尔王国的王位，就可以开始实行卡斯蒂尔王国此时迫切需要的改革了。
1474年，伊莎贝拉一世登上王位时，卡斯蒂尔王国经过恩里克四世的统治已经陷入绝境。众所周知，恩里克四世花钱大手大脚，而在执法方面鲜有建树。据当时一位卡斯蒂尔居民所述，谋杀、强奸和抢劫在当时都不会受到惩罚。正因为如此，伊莎贝拉一世迫切需要改革。根据伊莎贝拉一世采取的措施，当时的历史学家认为伊莎贝拉一世更倾向于正义而非仁慈。实际上，伊莎贝拉一世的丈夫斐迪南二世更加严厉无情。
伊莎贝拉一世的第一次重大改革是在1476年马德里加尔议会时期，以神圣兄弟会的形式开启。这时，虽然卡斯蒂尔王国并非第一次出现神圣兄弟会，但这是神圣兄弟会第一次被国王使用。中世纪晚期，“圣赫曼达”一词用来描述那些自发聚集在一起，通过在路上及乡村巡逻，惩罚罪犯，规范法治的一群人。从前国王通常会镇压兄弟会。1476年以前，卡斯蒂尔王国大部分地区的司法体系都由持不同政见的贵族牢牢控制，而非王室任命的官员。
为了解决这个问题，1476年，卡斯蒂尔、莱昂及阿斯图里亚斯建立了神圣兄弟会——圣赫曼达。圣赫曼达由当地人组成，负责监管王国内发生的犯罪行为。每一百户就要交一千八百马拉维迪的税。1477年，伊莎贝拉一世到访埃斯特雷马杜拉和安大路西亚，并在埃斯特雷马杜拉和安大路西亚也建立了神圣兄弟会。
伊莎贝拉一世继续法制改革。1481年，伊莎贝拉一世为了恢复加利西亚的秩序，任命了两位官员。从伊莎贝拉一世的父亲胡安二世起，加利西亚就是一个动荡的地方。强盗盘踞在道路、小镇和村庄附近。担负着恢复加利西亚秩序的艰巨任务的两位官员成功地将一千五百多名强盗从加利西亚驱逐出去。
伊莎贝拉一世从执政初期就充分认识到振兴卡斯蒂尔王国经济的重要性。恩里克四世的统治让卡斯蒂尔王国负债累累。调查发现，造成卡斯蒂尔王国贫困的主要原因是恩里克四世统治时期大规模转让王室财产。为了赚钱，恩里克四世以远低于其本身价值的价格把王室财产出售。1480年，托莱多议会得出结论：继续金融改革的唯一希望在于重新收回被转让的土地和租金。这一决定得到了许多宫廷贵族的热烈支持，但伊莎贝拉一世不太愿意采取如此激进的措施。最终的决定是，西班牙红衣主教对恩里克四世统治期间转让的土地和租金的使用期限进行调查。后来，许多贵族被迫为土地支付大笔金钱，王室财政变得越来越富有。不过，伊莎贝拉一世有个规定：不会取消送给教堂、医院及穷人的“礼物”。
关于经济的另一个问题是货币生产过剩。恩里克四世统治时期，常规生产货币的造币厂数量从五个增加到一百五十个，造币厂生产的大部分货币几乎一文不值。伊莎贝拉一世执政的第一年，她确立了皇家造币厂的垄断地位，并制定了一套货币制度必须遵循的法律标准。伊莎贝拉一世关闭了许多造币厂，王室直接控制货币的生产，伊莎贝拉一世恢复了公众对她自己管理国家财政能力的信心。
伊莎贝拉一世和斐迪南二世在各自的王国都建立了极少数新的行政机构。尤其是在卡斯蒂尔王国，伊莎贝拉一世的主要成就是更加有效地利用胡安二世和恩里克四世统治时期的制度。历史上，卡斯蒂尔政府的中心是王室。王室通常分为两个相互重叠的部分，第一部分由官员组成，主要是贵族，他们履行政府和政治职能，并因此获得报酬；第二部分由约两百名常任仆人组成，他们代表统治者履行大量保密职能。15世纪70年代，伊莎贝拉一世开始牢牢掌控王室行政，王室高级官员仅仅是个荣誉头衔，而且仅由贵族出任，而更加具有保密职能的职位通常由高级教士担任。尽管贵族们拥有头衔，但真正做事的是地位更低的人。
根据传统，卡斯蒂尔国王的主要顾问机构是卡斯蒂尔议会。在国王的领导下，议会有足够的权力解决所有法律和政治纠纷。议会负责监督所有高级行政官员。议会也是卡斯蒂尔王国的最高法院。1480年，托莱多议会期间，伊莎贝拉一世对卡斯蒂尔议会进行了许多改革。卡斯蒂尔议会从前拥有两类截然不同又相互重叠的王室议员，一类负责司法和行政，包括一些主教、贵族及受过法律培训的专业管理人员。还有一类传统议员，其角色不太正式，其作用很大程度上依赖个人的政治影响力。伊莎贝拉一世执政后，第二类议员被完全取消。
伊莎贝拉一世更加依赖专业的管理人员。他们大多是弱势贵族。卡斯蒂尔议会也被重组，正式任命一名主教、三名士绅、八名或九名律师。虽然贵族们不再直接参与国家事务，但议会欢迎他们出席会议。伊莎贝拉一世希望通过强迫贵族选择是否参与的方式将不愿献身国家事业的人排除在外。
伊莎贝拉一世认为，有必要建立国王和臣民之间的个人联系。因此，每周五伊莎贝拉一世和斐迪南二世都会留出一段时间坐下来接见投诉的臣民。这在卡斯蒂尔王国从未出现过的。卡斯蒂尔议会重组后由斐迪南二世和伊莎贝拉一世直接主持。虽然伊莎贝拉一世进行了许多看似让议会更加强大的改革，但实际上议会失去了政治权力，几乎成了一个被动的咨询机构，自动批准王室起草的立法。
托莱多议会改革后，伊莎贝拉一世任命著名法学家阿尔方索·迪亚兹·德·蒙塔尔沃清理法律并将剩下内容汇编成一部综合性的典籍。不到四年时间，阿尔方索·迪亚兹·德·蒙塔尔沃就完成了共八卷的作品，这部典籍在法学书籍中占有一席之地。
收复失地运动接近尾声时，只有格拉纳达还未被收复。从13世纪中期以来，格拉纳达一直由奈斯尔王朝控制。由于有天然屏障和坚固城镇，格拉纳达一直坚持到收复失地运动后期没有失陷。1482年2月1日，斐迪南二世和伊莎贝拉一世抵达麦地尔德凯姆普。这通常被认为这是格拉纳达战役的开始。征服格拉纳达共花了十年时间，战争在1492年到达顶峰。1492年1月2日，伊莎贝拉一世和斐迪南二世进入格拉纳达城接收城门钥匙。《格拉纳达条约》签署，斐迪南二世和伊莎贝一世在条约中承诺让格拉纳达的穆斯林和犹太人平静生活。
格拉纳达战役期间，伊莎贝拉一世注意到冈萨雷斯·费尔南德斯·德科尔多瓦出众的能力，因而委任他为谈判专员（共有两位谈判专员）。在伊莎贝拉一世的提携下，冈萨雷斯·费尔南德斯·德科尔多瓦继续了一段非凡的军事生涯，彻底改革了新兴的西班牙军队的组织与战术。
进入格拉纳达仅仅三个月后，伊莎贝拉一世同意资助克里斯托弗·哥伦布往西远航两千英里（克里斯托弗·哥伦布的说法），前往印度探险。
克里斯托弗·哥伦布于1492年8月3日出发，1492年10月12日抵达圣萨尔瓦多。之后，西班牙进入了探索与殖民的黄金时代。1494年，伊莎贝拉一世和斐迪南二世同意与葡萄牙国王若昂二世签署《托德西利亚斯条约签署》，瓜分欧洲之外的世界。葡萄牙不认可南美洲归西班牙，因为根据《托德西利亚斯条约签署》，南美洲在葡萄牙的势力范围内。葡萄牙国王若昂二世甚至威胁要派兵占领南美。
伊莎贝拉一世接收格拉纳达城门钥匙
格拉纳达陷落后阿罕布拉的穆罕默德十二世家族
伊莎贝拉一世不赞成克里斯托弗·哥伦布奴役美洲印第安人。她试图在“新大陆”执行在加纳利群岛的政策：所有人都是卡斯蒂尔王国的臣民，大多数情况下不能被奴役。然而，伊莎贝拉一世制定的政策几乎没有起任何作用。
这时，罗马天主教宗教裁判所建立，多米尼加的天主教修士托马斯·德·托尔克马达担任宗教裁判所大法官。斐迪南二世和伊莎贝拉一世实行政教合一的政策。虽然伊莎贝拉一世反对在经济上对犹太人采取严厉的措施，但托马斯·德·托尔克马达成功说服她。1492年3月31日，驱逐犹太人的《阿拉布兰诏书》签署。1492年7月底之前，犹太人必须离开西班牙。他们离开时不能带走金银财宝、武器和马匹。据说，西班牙有二十万犹太人。不过，现代历史学家指出这个数字有夸大之嫌：亨利·卡门已经表明，八万犹太人中最多有四万人离开，其余犹太人都皈依天主教了。
晚年的伊莎贝拉一世
教皇亚历山大六世授予伊莎贝拉一世“天主教君主”的头衔。西班牙不仅在地理上完成了统一，伊莎贝拉一世和斐迪南二世还试图让西班牙在宗教（罗马天主教）上完成统一。在这个过程中，宗教裁判所开始制度化。1499年穆斯林起义后，《格拉纳达条约》于1502年被破坏，穆斯林要么皈依基督教，要么离开西班牙。弗兰西斯科·吉麦内兹·德·西斯内罗斯主教被任命为托莱多大主教。弗兰西斯科·吉麦内兹·德·西斯内罗斯主教参与了西班牙宗教机构的复兴计划，为后来的反宗教改革奠定了基础。作为首席法官，他的权力越来越大。
伊莎贝拉一世和斐迪南二世建立了西班牙帝国。在接下来时间里，他们致力于国家管理，并努力将西班牙王室与欧洲其他王室联系在一起。1497年初，似乎一切就位了：伊莎贝拉一世的儿子、阿斯图里亚亲王、王位继承人胡安王子与奥地利的玛格丽特女大公结婚，从而与哈布斯堡王室建立了联系。伊莎贝拉一世的大女儿伊莎贝拉与葡萄牙国王曼努埃尔一世结婚，小女儿胡安娜与神圣罗马帝国皇帝马克西米利安一世的儿子腓力结婚。1500年，伊莎贝拉一世颁布法令，授予殖民地所有非叛逆土著公民权及法律上完全自由的权利。
不过，伊莎贝拉一世的独子、阿斯图里亚亲王胡安婚后不久就去世了，大女儿伊莎贝拉在生育儿子米格尔时难产而死，而米格尔也在两岁时夭折。
伊莎贝拉一世确实为三个女儿找对了结婚对象。伊莎贝拉一世的大女儿伊莎贝拉薨后，伊莎贝拉一世的三女儿玛丽亚嫁给了姐夫葡萄牙国王曼努埃尔一世。伊莎贝拉一世最小的女儿凯瑟琳先嫁给英格兰国王亨利七世的儿子及王位继承人威尔士亲王亚瑟。亚瑟薨后，凯瑟琳又嫁给亨利七世另一个儿子约克公爵亨利，即后来的英王亨利八世。
亨利七世
伊莎贝拉一世于1504年9月14日正式退出政治舞台，并于1504年11月26日驾崩。据说，从1497年阿斯图里亚亲王胡安薨后，伊莎贝拉一世就开始一蹶不振。伊莎贝拉一世被安葬在格拉纳达的王室礼拜堂，伊莎贝拉一世的丈夫斐迪南二世、女儿胡安娜、胡安娜的丈夫腓力一世、只有两岁的外孙米格尔也安葬于此。