赵用贤，字汝师，江苏常熟人。父亲承谦，广东参议。赵用贤隆庆五年(1571)中进士，选为庶吉士。
万历初年，授职检讨。张居正父亲死后不服丧，赵用贤上疏说：“我暗暗感到奇怪，张居正能以君臣大义效忠数年，却不能以父子之情稍尽心一日。我又暗地里奇怪，张居正的名望以数年累积而成，陛下却让它毁于一旦。不如像前朝的杨溥、李贤那样，让他暂时回去服丧，规定日期回来补缺，让他们十九年未见面的父子，能在抚棺恸哭的那一刻稍稍缓解心中的痛苦。国家设立台谏是为了整肃法纪，纠正过错，现在却因为恐惧威权请辅臣留下，违背公众的舆论而徇私情，蔑视人伦的纯厚性情而创立怪异之论。我愚蠢地暗自担心士风将日益颓靡，国家大事将日益混淆了。”疏奏上后，与吴中行同被廷杖除去官籍。赵用贤身体本来肥胖，巴掌大的肉因溃乱而掉落，他的妻子把肉晒干藏了起来。赵用贤有个女儿许配给吴之彦的儿子吴镇。吴之彦害怕连累自己，赶紧结交张居正，得到巡抚福建之职。经过家门，不向赵用贤行礼，而且让吴镇坐在他弟弟的下面，说“是婢女之子”，以此激怒赵用贤。赵用贤很愤怒，已察觉他是受张居正的党徒王..的指使，于是把礼金退还，回绝了这门亲事，吴之彦大喜。
张居正死后的第二年，用贤起用为旧职，升右赞善。江东之、李植等争相接见他，他的威望很高。但赵用贤性格刚直，恃才傲物，多次品评大臣的得失，申时行、许国等忌恨他。正好李植、江东之攻击申时行，许国竭力抨击李植、江东之，暗地里却责怪赵用贤、吴中行，说：“过去专权在权贵，现在却在下僚；昔日小人颠倒是非，现在却是君子。意气用事，偶然做成一、二件事，就自负得不得了，与浮浅、喜爱生事的人相呼应，党同伐异，行私罔上，这种风气不能助长。”于是赵用贤上疏辩白、请求离职，极力说明朋党之论的危害，在于小人以此赶去君子，使国家人才一空。言词很激愤，皇上不准他离去，朋党之争从此开始。
不久，他充任经筵讲席，又升右庶子，改任南京祭酒。推荐举人王之士、邓元锡、刘元卿，请加强圣学。又请求设立储君，饶恕言官李沂罪过。三年后，提升为南京礼部右侍郎。因为吏部郎中赵南星的推荐，改在京城任此职。不久，又以本官兼任教习庶吉士。
万历二十一年(1593)，王锡爵又进入内阁。起初，赵用贤回南方时，吴中行、沈思孝、李植、江东之已经被贬，或被罢官，故执政的人很安心。这时，赵用贤又以争三王同时分封的话中牵涉到王锡爵，被王锡爵所怀恨。改任吏部左侍郎，与文选郎顾宪成辩论人才，群情激愤，王锡爵颇感不安。赵用贤过去所回绝婚约的吴之彦，是王锡爵的里人，当时以佥事之职遭人弹劾当罢官，唆使他的儿子吴镇攻击赵用贤论财赶走女婿，蔑视法律废弃伦理。赵用贤上疏辩解，乞求退休。皇上下诏让礼官评议。尚书罗万化以吴之彦是他的门生，怕引起嫌疑极力推辞。王锡爵于是上疏说：“赵用贤轻易地回绝，吴之彦后来才揭发，都有过失。现在赵的女儿已出嫁了，难以询问当时的盟约，吴的儿子还没结婚，不能再反坐定罪。想采取折衷的办法，应让赵用贤称病归家，而宽恕吴之彦。”皇上下诏同意了。赵用贤于是免职回乡。户部郎中杨应宿、郑材又极力诋毁赵用贤，请依据法律从事。都御史李世达、侍郎李祯上疏替赵用贤抱不平，责备两人谄媚，于是遭攻击。高攀龙、吴弘济、谭一召、孙继有、安希范等都因申救被降职。从此朋党之争更加激烈。吴中行、赵用贤、李植、江东之首创于前，邹元标、李南星、顾宪成、高攀龙继续。言官更加注意品评执政之人，执政也日与其争持。水火不相容，到明代灭亡才停止。
赵用贤身长肩耸，意气风发，有经世大略。苏、松、嘉、湖诸府，财赋占天下的一半，老百姓贫困。赵用贤做庶子时，与进士袁黄商量了十天十夜，列出十四件事奏上。申时行、王锡爵认为吴人不应当谈论吴事，让皇上下圣旨严厉责备了他，建议没有实行。在家住了四年后死去。天启初年，赠为太子少保、礼部尚书，谥号文毅。