吴中行，字子道，江苏武进人。父亲吴性，哥哥吴可行，都是进士。吴性，官至尚宝丞。吴可行，为检讨。吴中行刚刚二十岁时就中了乡试，吴性告诫他不要急于求进士，于是他没有参加会试。隆庆五年(1571)中进士，选为庶吉士，授职编修。
大学士张居正是吴中行考进士时的主考官。万历五年(1577)，张居正的父亲死了，没有解职回乡奔丧，仍就执掌朝政。御史曾士楚、吏科都给事中陈三谟首先上疏奏请让他留下，满朝大臣都随声附和，唯独吴中行很气愤。刚好彗星出现在西南方，长度竟达到天际，皇上下诏让百官反省。吴中行于是首先上疏说：“张居正父子分处两地，双方已有十五年未见面。其父已死于数千里之外，陛下不让他星夜奔丧，抚棺恸哭，却一定要他违心地压抑感情，忍痛含悲于朝廷之上，并让他主持政务，执掌权柄，发扬功业，为国事操劳，这难道合乎情理吗？！张居正每每自言他谨守圣贤的义理和祖宗法度。宰我欲将丧期缩短，孔子说：‘宰我有三年的爱心于他的父母吗？’王子请求服几个月的丧期，孟子说：‘虽然增加一天已经超过了。’圣贤的训导怎么样？在法律上，虽然是老百姓、小官吏，隐匿丧情也是被禁止的，唯有武人得以穿黑色丧服不奔丧事，但这不是处置辅臣的办法。有人说过去也有起用之事，但也没有听说一天都不出京城大门，而立刻就任职的。祖宗的规矩如何呢？这件事关系到万古的纲常，天下的人都会看到、听到，唯有今天没有过失的举动，然后后世才没有令人遗憾的议论。亟待解决的问题莫过于此。”
奏疏已经上了，他把副本告诉张居正。张居正惊讶地说：“奏疏送进去了吗？”吴中行说：“没有送上不敢告诉你。”第二天，赵用贤的疏奏上。第三天，艾穆、沈思孝的奏也呈上。张居正发了火，与冯保商量，欲廷杖他们。翰林院侍讲赵志皋、张位、于慎行、张一柱、田一隽、李长春，修撰习孔教、沈懋学都上奏救他们，但奏疏都被阻止没有上报。学士王锡爵于是会同数十人，找张居正求和解，张不接受。于是廷杖吴中行等四人。第二天，进士邹元标上疏争辩，也被廷杖。这五个人正直的名声震动天下。吴中行、赵用贤并称吴、赵。南京御史朱鸿谟上疏救援五人，也被斥责。吴中行等受了廷杖后，校尉用布将他们拖出长安门，用木板抬着，当天就驱赶出都城。吴中行气息都没有了，中书舍人秦柱带来了医生，喂服了一勺子药，才苏醒。用车载着他南归，归家后，挖出腐肉数十块，大的如手掌，深寸许，一肢都挖空了。
万历九年(1581)全面考核京官，把五人列于考察名单上，将其禁锢不让任职。张居正死后，曾士楚应当巡按苏、松地区，他惭愧地说：“我有什么面目去见吴、赵二位大人呢！”于是声称有病走了。陈三谟已被提为太常少卿，不久与曾士楚都被弹劾而削去职务。朝廷大臣一起推荐吴中行，下诏起用为原官职，升为右中允，值经筵。大学士许国攻击李植、江东之，诋毁吴中行、赵用贤是他们一派的。中行上奏辩白，因而乞求回乡，皇上没有答应，又升为右谕德。御史蔡系周弹劾李植，又提到中行，中行请求免职，上了四道奏章。皇上下诏赏赐白金、文绮，乘驿马回去。后来言官屡屡推荐他，执掌大权的人有意抑制，不召他回京城。过了很久，起用为侍讲学士，执掌南京翰林院。同里之人佥事徐堂吉曾弹劾吴中行，事情已经了结，给事中王嘉谟又重提旧事弹劾他，朝廷命令他呆在家中等待征召。不久就死了。后赠为礼部右侍郎。