毛伯温，字汝厉，江西吉水人。祖父毛超，做过广西知府。伯温考中正德三年(1508)进士，初任绍兴府推官，后升任御史，先后巡按福建、河南。世宗即位后，宦官张锐、张忠等被判死刑，他们的同伙萧敬、韦靈暗中想拖延行刑。伯温上书请一并杀了萧敬、韦靈，宦官们因此才闭上了嘴巴。
嘉靖初年，伯温升为大理寺丞。后来又升为右佥都御史，巡抚宁夏。李福达一案被重新提起，伯温因为在大理寺时误判重罪，被罢官归乡。后来因为他人推荐恢复旧职，让他巡抚山西，又改为巡抚顺天，他都没有上任。朝廷于是让他改为办理都察院的事务，提升他为左副都御史。在这个职务上，他又受到赵王府的族人朱..椋的攻击，被解除官职听候考察。过后又被开除了职务。
十五年(1536)冬天，皇子出生，打算向外国颁布诏书。礼部尚书夏言认为安南多年不来朝贡，不应当派遣使节，并进而请讨伐它。世宗于是起用伯温为右都御史，让他和咸宁侯仇鸾整兵待命。伯温以父丧在身推辞，世宗不答应。第二年五月伯温到达京城，递上六条方略。恰好这时安南国王孙黎宁派遣陪臣郑惟僚等人来诉说莫登庸弑君篡权，请中国兴兵替他们复仇。世宗怀疑情况不真实，命令伯温暂缓出兵，传令两广、云南守臣调查以后报上来，同时让伯温协助办理都察院的事务。御史何维柏奏请让伯温守完丧，世宗不答应。伯温只好称病不出，一直到除丧服的祭祀过后才出来理事。这年冬天，伯温升任工部尚书。
十七年春天，黔国公沐朝辅等拿登庸的降表献给朝廷，请宽恕他的罪，允许安南来朝贡。在此之前，云南巡抚汪文盛奏称，登庸听说朝廷将发兵前往讨伐他，派人偷偷来侦察我们。世宗已传令要大臣按照以前的诏书出兵，文盛又采纳安南投降过来的武文渊的计策，上书说登庸可以拿下来的情况，一面又传檄要登庸向朝廷上表献地。到这个时候，世宗把朝辅的奏章交给大臣们讨论，大家都说不能答应他。世宗于是改命伯温担任兵部尚书兼右都御史，限期上任。世宗认为用兵的事关系重大，并没有非讨伐安南不可的意思，只是想威吓制服它而已。可是兵部尚书张瓒没有什么主见，完全视世宗的意思为可否。朝中大臣们多认为不该兴兵讨伐，只是不敢明白地谏阻。世宗的指示传下去几个月后，两广总督、侍郎张经递上一份用兵方略，并且说需要三十万士兵，一百六十万石粮饷。钦州知州林希元则极力说登庸不难拿下来，请立即出兵。张瓒不敢做决定，又奏请让大臣们公议。讨论过后递上去的决议又没有什么像样的计策，世宗感到不高兴，责怪了张瓒一番，军队又停止出征了。伯温受命再次协助办理按察院的事务。
第二年二月，世宗住在承天，诏令伯温去总督宣府、大同、山西的军务。不久选用东宫官员，又给他加官，兼任太子宾客。大同所管辖的镇边、镇川、弘赐、镇河、镇虏五座城堡，距城二百多里远，是接近敌人营帐的最边远地带。自从巡抚张文锦因为修筑这些城堡导致兵变后，没有人敢再主张维修它们了。伯温说：“兵变所以发生，是因为文锦用人不当，并不是他的建议有什么不对。”终于还是修复了这些城堡，招募三千士兵在这里防守，分给他们空闲的田地，永久地免除他们的田赋。边防依仗这一点很有威力。论功，伯温被晋升为太子少保。
这时，登庸害怕中国讨伐他，几次上书请求投降。世宗也想借此机会安抚他，就派侍郎黄绾去招安。黄绾过多地提出各种要求，世宗恼了，罢了黄绾的官。然后又下交群臣议论，大家都说应当讨伐他。世宗同意了，就在闰七月里命令伯温、仇鸾南征，文武三品以下官员不听命令的，允许他们按军法处治。伯温等到达广西后，召集总督张经，总兵官、安远侯柳王旬，参政翁万达、张岳等商定，征调两广、福建、湖广狼土官兵共十二万五千多人，分置三处哨所，从凭祥、龙峒、思陵州挺进安南，再用两支奇军作为声援部队。又传令云南巡抚汪文盛率兵驻在莲花滩，也分兵三路进军安南。部署已定，碰上仇鸾因罪被召回，就让柳王旬取代了他。嘉靖十九年(1540)秋天，伯温等人进驻南宁，传檄安南臣民，告诉他们大明王朝要复兴被登庸无理毁灭的国家，选择黎氏子孙继承祖宗的家国，只治登庸父子的罪，有带领郡县投降的，就拿这个郡县封赏他。又悬重赏缉拿登庸父子，同时传令登庸只要交上土地、人民的簿册并依此纳款，就照诏书中讲过的那些饶恕他的罪过。登庸非常害怕，派了使臣到万达那里求降，措辞很是可怜。万达把他们送到伯温那里。伯温奉命答应了，向他们传达了天子的恩德和威严，收取了安南国的地图、户籍，还有他们所归还的钦州四峒地区，暂且命令登庸的使臣回国听令。伯温把这些情况飞章上奏，世宗极为高兴，发布诏书把安南国改名安南都统使司，让登庸当都统使，世代相承，在境内分设十三个宣抚司，由他自己安排。伯温接受讨伐安南的任务一年多时间里，没射过一支箭，安南就被平定，这是因为世宗本来就不打算动兵的缘故。事后论功，伯温被加官为太子太保。
二十一年(1542)正月伯温回朝，仍旧办理都察院的职事。边关上几次传来警报，伯温请修建京师外城。世宗已批示说可以，给事中刘养直说修庙的工程正在进展中，物力跟不上，世宗就传令暂停修筑外城。当年十月，张瓒死了，伯温就代理兵部的事务。张瓒为人迷恋权柄，不能尽职，在兵部当了八年尚书，军事设施全给荒废了。伯温召集朝臣们商议后奏上二十四条防边建议，军令为之一新。有言官建议核实新军、京军及内府力士、工匠名额，以便节约开支，充实国库储备。伯温于是递上关于应当裁减的冗滥人员的二十多条意见，举凡锦衣、腾骧等卫，御马、内官、尚膳等监，这些一向被宦官们占据的部门，都在裁减之列。世宗称赞这个建议，命令立即照此清理。朝廷中多年来存在的这些弊端得到了很大改善，可是世宗身边的太监们这下却很不高兴。
二十三年(1544)秋天，顺天巡抚朱方因为防秋结束请撤回临时派驻的客兵。不多久，北寇大举入侵，直逼京师近郊。世宗大为震怒，一并逮捕了总督翟鹏，让他充了军，把朱方打死在大棍之下。御史舒汀说，朱方只是建议撤回蓟镇的客兵，主张把宣府、大同的客兵一起撤回的是伯温和职方郎韩最。世宗于是把伯温削除官籍，把韩最打了八十大棍，发配到最边远的地方充军去了。伯温回乡以后，背上长出疽疮死掉了。穆宗即位后，给他恢复了官职，并赐予恤典。天启初年，追谥他为“襄懋”。
伯温为人气宇深沉、坚强，吃饭、饮酒有十个人的容量。遇事决策，不动声色。在对安南的战争中，万达、张岳提出了很多计策。伯温极力向朝廷推荐他们，他们两个于是得到了任用。